Основные источники и способы выделения ЭСК

В начале 70-х годов ХХ века Л. Стивенс обнаружил высокую частоту спонтанного возникновения тератокарцином (ТК) в половых зачатках мышей. Среди конгломератов опухолевых клеток он наблюдал появление неорганизованных популяций различных дифференцированных клеток. Спонтанно возникшие тератокарциномы в культуре росли клонами пролиферирующих плюрипотентных клеток, из которых часть подвергалась спонтанной дифференцировке в специализированные клетки (производные всех трех зародышевых листков). Стивенс первый высказал догадку, что дифференцированные клетки образуются не из раковых клеток, а из малой примеси пролиферирующих плюрипотентных половых зародышевых клеток, которые он описал как "эмбриональные стволовые клетки" (ЭСК) [2].

В 1975 г Минц было доказано, что введение предимплнатационных зародышей мыши в любую ткань вне матки ведет к образованию опухоли из части клеток зародыша - эмбриокарцином (ЭК). Высокоочищенные линии эмбриокарциномы

были получены в результате многочисленных пассажей культуры. Авторы выявили сходство поведения и фенотипа ЭК и ТК. В культуре плюрипотентные клетки размножались клонами, причем часть клеток, покидавших клоны, подвергалась разнообразной спонтанной дифференцировке. При этом клетки в клоне продолжали интенсивно самообновляться после многочисленных пассажей. Таким образом было доказано, что плюрипотентность наследуется новыми поколениями клеток, возникающими в клоне, однако быстро теряется вне клонов [2]. В дальнейшем было изолировано более 100 линий эмбриокарцином и тератокарцином.

Качественные сдвиги в получении ЭСК возникли в 1998 г после изолирования бессмертных линий ЭСК человека под руководством Томсона и Герхарда. В 1998 г институт репродуктивной биологии в Норфолке (Канада) первым наладил производство бластоцист человека из банка спермы и яйцеклеток, изолировал 5 линий ЭСК из замороженных бластоцист.

Для неограниченного размножения ЭСК в культуре в ростовой среде должны присутствовать три фактора:

) интерлейкин-6;

2) фактор стволовых клеток (SCF);

) лейкозингибирующий фактор (LIF).

ЭСК должны выращиваться на подложке (фридере) из эмбриональных фибробластов в присутствии фетальной телячьей сыворотки [4].

Ранние (предимплантационные) зародыши и фетальная абортная ткань остаются главными источниками ЭСК. У зародыша на стадии бластоцисты впервые четко разделены тотипотентные стволовые клетки эмбриобласта и поддерживающие клетки трофобласта.

Лишь небольшая часть клеток эмбриобласта бластоцисты сохранет тотипотентность.1-2% клеток удается переводить в бессмертную самовоспроизводящуюся линию ЭСК [2]. Получение из эмбриобласта линии ЭСК начиналось с механического отделения эмбриобласта от трофобласта. Затем фрагменты эмбриобласта помещали на фидер без факторов, ограничивающих пролиферацию тотипотентных клеток. В дальнейшем клетки разобщались и пересаживались на новый фридер, на котором таким образом получали стабильные культуры СК.

Нейросферы, выделенные из фетальной мозговой ткани 8-12 нед. и 17-21 нед. гестации, характеризовались весьма выраженной морфологической и иммунофенотипической гетерогенностью (различные размеры клонов и формы клеток в клонах).